HIV融合抑制剂ADS-J1的药物耐受机制及其与临床抗HIV药物的协同作用

【摘要】艾滋病(AIDS)是一种由人类免疫性缺陷病毒(HIV)引起的一种后天性细胞免疫功能出现缺陷而导致严重随机感染及/或继发肿瘤并致命的一种疾病。HIV病毒分为两种：HIV-1,HIV-2。HIV-1的毒性与传染性均高于HIV-2,因此目前主要针对HIV-1进行大量的研究。HIV-1为带有Ⅰ型膜融合蛋白的包膜病毒,它进入靶细胞首先是利用它的包膜表面gp120亚基与靶细胞主要受体CD4和辅助受体CCR5或者CXCR4先后发生结合,导致它的跨膜亚基gp41构象发生改变,其N端融合肽插入到宿主细胞膜中,gp41形成gp41NHR三聚体形式的中间态,然后,gp41的NHR和CHR区域形成稳定的6-HB结构,引起病毒包膜与靶细胞膜的融合。在gp41NHR的沟槽内有一个深的疏水口袋区域,并且这个区域对于HIV-1病毒的膜融合和6-HB的稳定性非常关键,因此,这个疏水区被认为是发展HIV融合抑制剂的重要靶点。利用计算机辅助设计,将gp41口袋区作为靶点,并结合本室建立以ELISA为手段的gp416HB抑制实验,Jiang等人成功地筛选出ADS-J1小分子化合物,它抑制HIV介导的细胞融合和HIV-1复制活性达到低微摩尔水平。机制研究表明,ADS-J1能够和一个可溶性杂交分子IQN17结合,并且能够显著抑制PIE7与IQN17口袋区特异性地结合。IQN17是由GCN4序列和形成疏水口袋区的N-多肽N17联接组成,它可以模拟形成gp41三聚体上的口袋区结构。PIE7是一个能与IQN17口袋区特异性地结合的短肽。另外,ADS-J1能够阻止衍生于病毒gp41NHR和CHR多肽所模拟的6-HB的形成。计算机模型分析表明,ADS-J1的磺酸基团能够与gp41口袋区的第574位带正电荷的赖氨酸(K574)结合,但是将带负电荷的氨基酸替代K574后则完全消除了ADS-J1与gp41口袋区的结合。然而,Este等人认为ADS-J1既不作用于gp41口袋区,也不作用于gp41其它区域,而是靶向gp120的V3区域。这主要源于他们没有诱导出突变点位于gp41口袋区的ADS-J1抗性株,相反,他们诱导出了位于gp120V3区域的ADS-J1抗性株。然而,他们选用的HIV-1病毒株是AR177(靶向gp120的抑制剂)抗性株或者相关病毒株作为野生型毒株,在ADS-J1存在下,侵染MT-4细胞进行诱导突变。由于他们没有设计一个靶向gp41口袋区的肽或者小分子化合物作为对照,因此这些结果不是令人信服的。因此,本课题主要以ADS-J1为研究对象,利用gp41口袋区的假病毒突变株和HIV-1T-2635耐药性病毒株,探讨了ADS-J1的耐受机制。另外,对ADS-J1进行了抑制T-20耐受株、HIV-1临床分离株的活性研究。同时,进行了将ADS-J1与不同机制的抗病毒药物联合应用时抑制HIV-1IIIB和HIV-1Bal的活性研究,评估了它们潜在的协同效应。实验方法：1)Gp41口袋区Q64和A67突变对ADS-J1抑制HIV-1病毒活性的影响。利用FuGENE6转染试剂转染的方法,对以前构建好的假病毒Q64A,Q64L,A67G和A67S进行病毒包装；测定标准p24蛋白的不同浓度与对应的A450值,绘制标准曲线,根据标准曲线计算出假病毒中p24蛋白的含量；将浓度为250ngp24/ml的假病毒与1×105/ml的TZM-B1细胞共同培养,测定假病毒感染性；将浓度为250ngp24/ml的假病毒,与不同浓度的ADS-J1,对照抑制剂C34、T20分别孵育30min,加入密度为1×105/ml的TZM-B1细胞,感染72h后,测定相应的荧光吸收值,采用Calcusyn软件计算IC50。2)T-2635耐药株对ADS-J1抑制HIV-1病毒活性的影响。采用CaCl2转染的方法将T-2635耐药株质粒转染至293T细胞中,72h后收集T-2635耐药株上清病毒粒子,然后将其侵染MT-2细胞,进一步扩增病毒,根据CPE现象,在感染4-7天后收集病毒上清；根据标准曲线计算出T-2635耐药株p24蛋白的含量；在测定这些抗性株具有感染性后,将浓度为5ngp24/ml的T-2635耐药株与不同浓度的ADS-J1,对照抑制剂T2635、AZT分别孵育30min,加入密度为1×105/ml的TZM-B1细胞,感染72h后,测定相应的荧光吸收值,采用Calcusyn软件计算IC50。3)N36Fd和它的突变体N36(Q64A)Fd,N36(Q64L)Fd,N36(A67G)Fd,N36(A67S)Fd,N36(Q66R)Fd构建、蛋白表达和纯化。采用PCR方法分别扩增出Fd片段、N36及其突变体片段,然后进行二次PCR将N36及其突变体分别和Fd片段连接上,构建出N36Fd和它的突变体；在0.1mM诱导剂IPTG存在下,采用原核表达的方法,表达出上述6种蛋白；利用Glutathione-Sepharose4B层析柱以及3KD、30KD浓缩管,进行蛋白的浓缩、纯化。4)天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(N-PAGE)检测ADS-J1对N36Fd及其突变体和C34相互结合形成的复合体6-HB的抑制作用。将N36Fd及其突变体分别加入PBS或者不同浓度的ADS-J1,孵育30min后,加入C34在共同孵育30min。N36Fd及其突变体蛋白、C34终浓度为10μM。孵育好的样品混合液与2×Nativesamplebuffer等体积混匀,加样于预制的18%Tris-glycinegel孔中。恒压125V,室温下电泳2h。用染色剂考马斯亮蓝R250染色2h,脱色后用FluorChem8800凝胶成像仪拍照记录。5)圆二色光谱(CD)检测ADS-J1对N36Fd及其突变体和C34相互结合形成的复合复合螺旋构象的干扰作用。将N36Fd及其突变体分别加入PBS或者不同浓度的ADS-J1,孵育30min后,加入C34在共同孵育30min。N36Fd及其突变体蛋白、C34终浓度为10μM,ADS-J1终浓度为50μM。参数设置：检测温度：4℃；样品池：0.1cm；波长扫描范围：180-300nm；波宽：5.0nm；狭缝0.1nm；时间常数4.0s；扫描速度：50]mm/min。将孵育好的样品加入CD特定比色皿中,进行CD波长扫描,保存CD信号[θ]222nm值,并计算出α-螺旋值。6)等温滴定量热技术(ITC)检测ADS-J1对N36Fd和它的突变体的结合能力。将50μM的N36Fd或者它的突变体蛋白加入样品池中,将750μMADS-J1逐滴滴入至样品池中。设置滴定间隔为200sec,滴定体积为10μL/滴,搅拌速度是350rpm。用软件LaunchNanoAnalyze计算热力学常数。7)ADS-J1抑制HIV-1T-20耐药株活性检测。利用MT-2细胞扩增出HIV-1T-20耐药株后,根据标准曲线计算出p24蛋白的含量,按照Reed&Muench法计算病毒TCID50。将100倍50%组织感染浓度TCID50的HIV-1T-20耐药株,与不同浓度的ADS-J1,阳性对照T20分别孵育30min,加入密度为1×105/ml的MT-2细胞,感染4天后,观察细胞病变效应CPE,取培养上清,并加入等量5%TritonX-100裂解病毒,ELISA方法测定上清中p24抗原含量,采用Calcusyn软件计算IC50。8)ADS-J1抑制HIV-1临床分离株活性检测。利用CEMx1745.25M7细胞扩增出HIV-1临床分离株后,根据标准曲线计算出p24蛋白的含量,按照Reed&Muench法计算病毒TCID50。将100倍50%组织感染浓度TCID50的HIV-1临床分离株与不同浓度的ADS-J1,阳性对照T20分别孵育30min,加入密度为5×105/mL的CEMx1745.25M7细胞后,培养7天后取培养上清,并加入等量5%TritonX-100裂解病毒,ELISA方法测定上清中p24抗原含量,采用Calcusyn软件计算IC50。9)ADS-J1与不同机制的抗病毒药物联合应用时抑制HIV-1IIIB的活性检测。利用MT-2细胞扩增出HIV-1IIIB后,根据标准曲线计算出p24蛋白的含量,按照Reed&Muench法计算病毒TCID50。将不同浓度的ADS-J1和不同机制的抗病毒药物混合液倍比稀释,加入100倍50%组织感染浓度TCID50的HIV-1IIIB,孵育30min后加入密度为1×105/ml的MT-2细胞,感染4天后,观察细胞病变效应CPE,取培养上清,并加入等量5%TritonX-100裂解病毒,ELISA方法测定上清中p24抗原含量,采用Calcusyn软件计算IC50。10)ADS-J1与不同机制的抗病毒药物联合应用时抑制HIV-1Bal的活性检测。利用CEMx1745.25M7细胞扩增出HIV-1Bal后,根据标准曲线计算出p24蛋白的含量,按照Reed&Muench法计算病毒TCID50。将不同浓度的ADS-J1和不同机制的抗病毒药物混合液倍比稀释,加入100倍50%组织感染浓度TCID50的HIV-1Bal,孵育30min后加入密度为5×105/mL的CEMx1745.25M7细胞,培养7天后取培养上清,并加入等量5%TritonX-100裂解病毒,ELISA方法测定上清中p24抗原含量,采用Calcusyn软件计算IC50。实验结果：1)Gp41口袋区带有突变点的假病毒侵染性降低,且这些假病毒对ADS-J1和C34具有高的抗性,但对T-20却相对敏感的。单次感染实验结果表明,与野生型相比,带有突变点病毒的感染性有显著性差异,并具有统计学意义(F=604,P<0.001),Q64A和Q64L的突变使HIV-1假病毒的侵染能力大概只有野生型病毒的34%和27%,A67G和A67S的突变使使HIV-1假病毒的侵染能力大概只有野生型病毒的57%和31%。所有的突变株假病毒对ADS-J1和含有口袋区的C肽C34产生高的抗性,其中对ADS-J1了30-91倍的抗性,对C34产生了103-244倍的抗性,而对不含口袋区的C肽T-20相对敏感的,以上结果表明ADS-J1可能主要作用于HIV-1gp41NHR的口袋区。2)T-2635耐药株也对ADS-J1产生了抗性。我们选择了7株带有单突变点,4株带有双突变点,和2株带有多突变点的T2635耐药株对T2635,ADS-J1,AZT(逆转录酶抑制剂做为对照)的进行敏感性检测。实验结果表明,单突变株对T2635产生一定抗性,为4到7倍的抗性,双突变株对它产生了较高的抗性,为13到23倍,而多突变株对它产生了非常高的抗性,达到36到263倍,这些与以前报道一致。与T2635相似的是,随着突变点的增多,对ADS-J1产生的抗性也相应增加。相关性分析表明,这些病毒株对T2635和/SDS-Jl抗性具有相关性(r=0.946,P>0.001)。这些结果说明,ADS-J1和T2635可能有相似的作用机制,都是作用于gp41区域。3)N36Fd和它的突变体的构建。通过两次PCR反应,构建了编码N36Fd和它的突变体基因片段。然后将其插入带有BamHI和Xhol酶切位点的pGEX-6P-1表达载体中,经测序鉴定后筛选出了具有正确序列的克隆载体N36Fd-pGEX6p-1,N36(Q64A)Fd-pGEX6p-1,N36(Q64L)Fd-pGEX6p-1N36(A67G)Fd-pGEX6p-1,N36(A67S)Fd-pGEX6p-1,和N36(Q66R)Fd-pGEX6p-1。利用原核表达蛋白的方法,表达出了N36Fd及其突变体蛋白,纯化后采用聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)的方法进行了鉴定。4)与抑制N36Fd和C34形成6-HB的能力相比,ADS-J1抑制N36Fd突变体和C34形成6-HB的作用降低。N-PAGE实验结果显示,在ADS-J1存在下,C34能够和N36Fd以及它的突变体N36(Q64A)Fd,N36(Q64L)Fd,N36(A67G)Fd,N36(A67S)Fd和N36(Q66R)Fd形成6-HB结构,表明这些突变点没有显著影响6-HB的形成。但是,随着ADS-J1浓度增加,6-HB条带越来越弱,同时C34条带越来越强。对于N36Fd来说,当ADS-J1达到100μM时,能够完全阻止N36Fd和C34形成6-HB。相比而言,对于突变体N36(Q64A)Fd,N36(Q64L)Fd,N36(A67S)Fd和N36(Q66R)Fd,当ADS-J1达到200μM时,才能够完全阻止N36Fd和C34形成6-HB。另外,对于突变体N36(A67G)Fd,当ADS-J1达到400μM时,才能够完全阻止N36Fd和C34形成6-HB,这些结果表明,ADS-J1抑制突变体N36Fd和C34形成6-HB的能力减弱。5)与干扰N36Fd和C34形成的二级构象相比,ADS-J1干扰N36Fd突变体和C34形成二级构象的作用降低。CD结果显示,Q64,A67,Q66三个位点突变后,能够影响N36Fd和C34形成的6-HB的构象和稳定性,野生型N36Fd和C34可以形成92.8%的α-螺旋含量,突变后的N36Fd和C34形成的α-螺旋含量降低至43.9%到59.1%。在加入ADS-J1后,野生型N36Fd和C34形成的α-螺旋含量从92.8%降低至56.2%。相比而言,ADS-J1的加入对于突变后的N36Fd和C34形成的α-螺旋含量没有显著影响,这说明突变后的N36Fd与ADS-J1结合力降低。6)与N36Fd和ADS-J1的结合能力相比,N36Fd突变体和ADS-J1的结合能力减弱。ITC结果显示,野生型N36Fd与ADS-J1解离常数为1.91×10-7M,5个突变株与ADS-J1结合力降低2-10倍(解离常数为5.21×10-7-1.76×10-6M),滴定实验表明,ADS-J1与N36Fd或者它的突变体的化学比为1.5-2.7：1,而不是1：1,这说明大约两分子的ADS-J1可以与一分子的N36Fd或者它的突变体结合。7)ADS-J1有效对抗T-20耐药株。病毒抑制实验结果表明,ADS-J1能够有效抑制T-20耐药株和T-20敏感株的感染,其ICso范围为0.85到1.98μM。8)ADS-J1有效对抗HIV-1临床分离株。病毒抑制实验结果表明,ADS-J1能够有效的抑制A亚型-F亚型及O亚型的临床分离株,其IC50范围为0.64到2.26μM。9)ADS-J1与不同机制的临床使用抗HIV-1药物联合应用抑制HIV-1IIIB(X4毒株)具有协同作用。将ADS-J1与不同机制的抗病毒药物联合应用抑制HIV-1IIIB的协同效果进行分析。利用Calcusyn软件计算协同指数(CI)的CI50。当CI50<0.1代表很强协同效应,CI50=0.1-0.3说明强协同效应,CI50=0.3-0.7说明具有协同效应,CI50=0.7-0.85明具有弱协同效应,而当CI50=0.85-0.90说明具有轻微协同效应。ADS-J1与两种融合抑制剂(T-20和SFT)能引起很强的协同作用或协同效应,其对抗HIV-1IIIB的协同作用指数CI50分别为0.085和0.342；与三种逆转录酶抑制剂(AZT、D4T和TMC120)能引起微弱协同作用或协同效应,其对抗HIV-1IIIB的协同作用指数CI50分别为0.926、0.489和0.322；与三种蛋白酶抑制剂(Kaletra、Invirase和Agenerase)能引起协同效应或强的协同作用,其对抗HIV-1IIIB的协同作用指数CI50分别为0.548、0.210和0.166；与整合酶抑制剂Raltegravir能引起协同效应,其对抗HIV-1IIIB的协同作用指数CIs0为0.462。10)ADS-J1与不同机制的临床使用抗HIV-1药物联合应用抑制HIV-1Bal(R5毒株)具有协同作用。将ADS-J1与不同机制的抗病毒药物联合应用抑制HIV-1Bal的协同效果进行分析。ADS-J1与两种融合抑制剂(T-20和SFT)能引起协同效应或很强的协同作用,其对抗HIV-1Bal的协同作用指数CI50分别为0.673和0.128；与三种逆转录酶抑制剂(AZT、D4T和TMC120)能引起微弱协同作用或协同效应,其对抗HIV-1Bal的协同作用指数CI50分别为0.896、0.312和0.792；与三种蛋白酶抑制剂(Kaletra、Invirase和Agenerase)能引起强协同作用或弱协同作用,对抗HIV-1Bal的协同作用指数CI50分别为0.107、0.738和0.113；与整合酶抑制剂Raltegravir能引起协同效应,其对抗HIV-1Bal的协同作用指数CI50为0.491。结论：1)HIV-1假病毒中gp41的NHR上口袋区的Q64和A67两个位点的突变导致这些假病毒对ADS-J1产生抗性。2)T2635耐药株中gp41区域内的单位点突变,双位点突变,多位点突变也会导致这些病毒对ADS-J1产生抗性。3)天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(N-PAGE)实验结果分析确定,N36Fd在口袋区突变会造成ADS-J1抑制C34和N36Fd三聚体形成的6-HB的活性降低。4)圆二色光谱(CD)实验结果分析确定,N36Fd在口袋区突变会造成ADS-J1干扰C34和N36Fd三聚体作用形成复合螺旋构象的能力降低。5)等温滴定量热技术(ITC)实验结果分析确定,N36Fd在口袋区突变会造成ADS-J1与N36Fd三聚体结合能力减弱。6)ADS-J1能够有效抑制T-20耐药株和HIV-1临床分离株。7)ADS-J1与目前临床应用的HIV-1融合抑制剂,逆转录酶抑制剂,蛋白酶抑制剂,整合酶抑制剂合用都能产生协同效应抑制X4型(IIIB)R5型(Bal)HIV-1毒株。8)作用于gp41口袋区的小分子HIV融合抑制剂是一种新型抗HIV药物,可以利用ADS-J1作为先导化合物来开发用于治疗那些对当前药物已产生耐受作用的艾滋病病人。
【作者】于飞；
【导师】姜世勃；刘叔文；
【作者基本信息】南方医科大学，药理学，2014，博士
【关键词】ADS-J1；N36Fd；T-20耐药株；HIV-1临床分离株；协同作用；

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